مقاله کامل كنه نروماده, تخم و لارو آن، كه متعلق به سه منطقه بوشهر، كردان كرج و بوئين زهرا

نتايج
4-1:انتخاب نمونه:
نمونه‌ها شامل, كنه نروماده, تخم و لاروآن، كه متعلق به سه منطقه بوشهر، كردان كرج و بوئين زهرا (گوشه گويي و عصمت آباد) بودند، از بخش تك ياخته شناسي آزمايشگاه تحقيقات بندپايان مؤسسه سرم سازي رازي و همچنين طي مطالعات شخصي خود در بوئين زهرا تهيه شده بودند.
نمونه‌هاي كنه در قالب سه گروه كه از هر گروه (منطقه) تعدادي نمونه براي استخراج DNA در نظر گرفته شدند، علاوه بر آن تعدادي از نمونه‌ها نيز به منظور حفظ كيفيت و علي‌الخصوص براي جلوگيري از تبديل تخم كنه كه در دماي اتاق صورت مي‌گيرد، در دماي 5 درجه سانتيگراد در يخچال نگهداري شدند.
4-2: استخراج DNA ژنومي و ارزيابي كيفيت آن:
4-2-1: پودر نمونه‌ها:
بعد از تهيه كنه ها، به ميزان 15 تا 20 ميلي گرم از تخم كنه هيالوما آناتوليكم آناتوليكم كه در داخل تانك حاوي ازت مايع و با استفاده از ميله پلاستيكي استريل نمونه كاملاً پودر شدند. با توجه به روشهاي مختلف استخراج DNA (به بخش (1) در جدول شماره ( 1-7) رجوع شود)
در مورد كنه هيالوما روش فنل كلروفرم به همراه پروتئينازK (d’oliveriaetali; 1997) و روش استخراج به كمك جذب برروي فيبر شيشه (كيت) انتخاب گرديد.
2-2-2- استخراج DNA به روش فنل – كلروفرم به هماره پروتئيناز K:
در بررسي روشهاي جداسازي و خالص سازي DNA ژنومي بهترين كيفيت DNA در استخراج با فنل – كلروفرم – ايزوآميل الكل به دست آمد و بر روي ژل آگارز حداقل اسمير مشاهده گرديد. (شكل شماره 3-1)
3-2-2- استخراج DNA به كمك جذب بر روي فيبر شيشه (كيت):
در روش استخراج بر روي فيبر شيشه متصل گرديده و پس با شستشو خارج گرديد. (شكل شماره3- 1) در اين روش عليرغم داشتن راندمان بالاتر ميزان اسمير مشاهده شده در DNA ژنومي بيشتر بود.
پس از تعيين غلظت DNA استخراج شده از آن جهت آزمايش PCR مورد بررسي قرار گرفت.

2 M 1
شگل شماره (3-1) تصوير استخراجDNA روي ژل 5/1%آگارز با روش جذب روي فيبر شيشه (كيت) (رديف يك)و فنل – كلروفرم (رديف2)از نمونه تخم كنه منطقه بوئين زهرا. مشاهده مي شود با روش استخراج با كيت اسمير بيشتري وجود دارد .
M:100bp:سايز ماركر
3- 2واكنش زنجيره‌اي پلي مراز (PCR):
واكنش (Polymerase Chain Reaction) PCR كه امكان توانايي تكثير قطعات خاص DNA را دارد. در اين تحقيق مورد استفاده قرار گرفت.
آزمايش PCR با نمونه‌هاي DNA استخراج شده از مراحل مختلف سيكل زندگي كنه هيالو، آنا توليكم كه شامل تخم, كنه ماده با لغ خون خورده و كنه نر بودند انجام گرديد.
3-3- بهينه سازي PCR:
بازده PCR وابسته به فاكتورهاي مختلفي از جمله كيفيت و غلظت DNA الگوي دماي اتصال (anmealing) زمان تكثير (Extention)، طول تكثير ((Extention, غلظت آنزيم DNA Polymerase و غيره ميباشد، در اين ارتباط با بهينه نمودن يكسري از اين فاكتورها.سعي در كسب نتايج كاملا مطلوب و قابل قبول گرديد.
3-3-1- تعيين الگوي حرارتي مناسب:
3-3-1-1- 1دماي اتصال (annealing): مرحله اتصال آغازگر ها به مولكول DNA هدف مي‌باشد كه بلافاصله بعد از مرحله دناتوراسيون انجام مي‌گيرد. با استفاده از دستگاه PCR (ترموسايكر) با قدرت اعمال گراديانت درجه حرارت، درجه حرارتهاي مختلف براي هر يك از آغازگرهاي ذكر شده بطور جداگانه مورد بررسي قرار گرفت، كه در اين ارتباط از دماي اتصالºc 54 درجه سانتيگراد و رنج دمايي (G=4ºc)، بكار گرفته شد. (جدول شماره 3-1)
بهترين درجه حرارت اتصال (annealing)، براي اتصال جفت آغازگر و 155u19/515L19دماي 4/56 (شكل شماره3-2) و براي جفت آغازگر 1046U19/1324L20 دماي 4/56 (شكل شماره 3-3). جفت آغازگر 1324U20/1915L18، دماي 9/57 (شكل شماره
3-4) و براي حفت آغازگر 5RBm86/RBm86cدماي 5/50 بدست آمد. (شكل شماره 3-5).
لازم به ذكر است از جفت آغازگر FBm86c/3RBm86 هيچ باندي قابل مشاهده نبود. (شكل شماره 3-5)
جدول شماره (2-1) نمايش درجه حرارتهاي مختلف توسط دستگاه PCR در T=54 و G=4 ( درجه سانتيگراد)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
57.9 57.2 56.4 55.4 53.2 52.1 51.1 50.1
شكل شماره (3-2): تصوير محصول PCRاز نمونه تخم كنه منطقه بوئين زهرا, روي ژل 5/1% آگارز.براي بهينه سازي محصول PCRبا جفت آغاز گر (155U19/515L19)از دماي گراديانت (54OC+G)استفاده شد.مشاهده
مي شود باند ايجاد شده در دماي (56.4OC)وضوح خوبي داشته و ميزان اسمير آن كم مي باشد .
M:1kb:سايز ماركر

9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
57.9 57.2 56.4 55.4 53.2 52.1 51.1 50.1
شكل شماره (3-3): تصوير محصول PCRاز نمونه تخم كنه منطقه بوئين زهرا روي ژل 5/1% آگارز.براي بهينه سازي محصول PCRبا جفت آغاز گر (155U19/515L19)از دماي گراديانت (54OC+G)استفاده شد.مشاهده مي شود باند ايجاد شده در دماي (56.4OC)وضوح خوبي داشته و ميزان اسمير آن كم مي باشد
M:1kb:سايز ماركر

M 1 2 3 3 5 6 7 8
50.1 51.1 52.1 53.2 55.4 56.4 57.2 57.9
شكل شماره (3-4) تصوير محصول PCRاز نمونه تخم كنه منطقه بوئين زهرا روي ژل 5/1% آگارز.براي بهينه سازي محصول PCR) با جفت آغاز گر(1324U20/1915L18) از دماي گراديانت (54OC+G)استفاده شد.مشاهده مي شود ميزان اسمير باند ايجاد شده در دماي (57.9OC) كمتر از ساير باندهاست .
M:1kb:سايز ماركر

فایل : 48 صفحه

فرمت : Word