مقاله فارسی تاثیر لیزوزیم روی میکروارگانیزم های گرم مثبت کشته شده با حرارت

تاثیر لیزوزیم روی میکروارگانیزم های گرم مثبت کشته شده با حرارت
خلاصه :
تغییر در واکنش رنگی کننده گرمی که زمانی رخ می دهد که دوکسانان ولچی و استافیلوکوک آلباس گرم مثبت با لیزوزیم کشت می شوند به خاصر برداشت ترکیب اسیدریبونوکلئیک مجموعه گرمی است و تقریبا بواسطه هیدرولیز برخی پیوندهای شکر در پلی ساکاریدهای واقع شده در سطح سلول ایجاد می شود. لیزوزیم ، آنزیم موجود در سفیده تخم مرغ که مواد معلق زنده ریزترکیزه های پوده زی مستعد، مخصوصا ریزترکیزه لیزودکتیکوس ، را می کافند از زمان کشف آن توسط فلکمینگ در 1922 در معرض بررسی های متعدد بوده است . اینها توسط مسروبینوو نوپل ( 1938 ) و تامپسون ( 1945 ) مرور شده اند. این آنزیم یک پروتئین بنیادی یا پلی پپتید باوزن مولکولی 2500-18000 حاوی تقریبا 16% نیتروژن و 2-3% سولفور می باشد. جداسازی و تصفیه لیزوزیم اخیرا بهبود یافته با روشی که شامل جذب مستقیم آنزیم از سفیده تخم مرغ طبیعی با بنتونیت می باشد و تا شویش با پیریدین آبکی 5% مطابق با PHS با اسید سولفوریک دنبال می شود .
نخستین تلاش برای بررسی عملکرد لیزوزیم توسط مپر، پالمر، تامیسون و کوراز ( 1936 ) انجام شد. متاسفانه این نویسندگان از آنزیم تهیه شده از گونه
سارسینای پذیرای لیزوزیم سفیده تخم مرغ که دارای خواص مشابه آنزیم دوم است اما احتمالا حاوی سیستم آنزیمی خود …. سارسینا بوده است استفاده می کردند. این آنزیم روی پیوندهای قندی برخی کربوهیدراتهای حاوی قندهای آمین دار تاثیر خاصی دارد بنابراین از پیشنهاد و گفته اصلی هالائور حمایت می کند . با این وجود این بافته برای لیزوزیم سفیده تخم مرغ بکار نمی رود . اپستین و چاین یک شکنه پلی ساکارید را از اجسام سلولی ریزترکیزه لیزودکتیکوس و باکتری های حساس دیگر که بواسطه لیزوزیم با تولید هگزو سامین استیل N هیدولیز می شود جدا کردند. پلی ساکارید در همه ارگانیزم های حساس نسبت به لیزوزیم یافت شد ، بیشترین مقدار باسیلوس سولتیلیس ، ارگانیزمی که بواسطه لیزوزیم کشته می شد اما کافته نمیشد ، موجود بود. میروهاهنل این حقیقت را تائید کردند که لیزوزیم یک شکنه کربوهیدرات جدا شده از عصاره های هیدروکسید سدیم ارگانیزم های مستعد را هیدرولیز میکرد. مسیر عملکرد لیزوریم را بر حسب هیدرولیز یک پلی ساکارید در غشای باکتری توضیح می داد. این موکوپلی ساکارید که ظاهرا بطور محکم به غشای باکتری همبسته است ، نخست بواسطه لیزوزیم با جذب آب بعدی بواسطه این ارگانیزم و فروپاشی سلول تجزیه می شود. آنزیم های خودکافت ، فعال بعد از مرگ ارگانیزم ها ، تصور می شد تا حدودی مسئول آشکار کردن مواد معلق باکتری می باشند.
تاثیر لیزوزیم روی باکتری گرم مثبت
ممکن است که خنثی سازی حرارتی سیستمهای آنزیمی خود کافت در توضیح مقاومت سلولهای کشته شده در مقابل کافتندگی کامل بواسطه لیزوزیم نسبت به این حقیقت که پروتئین های سلولی روی حرارت نا محلول می شوند ، از اهمیت بیشتری برخوردار باشد. کافتندگی باکتری بواسطه لیزوزیم بواسطه تبدیل سلولهای گرم مثبت به اشکال گرم منفی مقدم می باشد ، این نیز زمانی رخ می دهد که مواد معلق سلولهای کشته شده با حرارت با لیزوزیم کشت می شوند . تامپسون و دوبوس نشان دادند که نخستین قدم خود کافت پنوموکوک سخت نوع II ، یعنی تبدیل آن از گرم مثبت به گرم منفی بدون فروپاشی ساختار سلولی ، بواسطه ازادسازی ریبونوکلئوپروتئین و اسیر ریبونوکلئیک انجام می شود. اخیرا هنری و استاسی نشان داده اند که سلولهای مناسب گرم مثبت می تواند بواسطه استخراج با محلول کولیک سدیم در 60 درجه به گرم منفی فرمالدئید رقیق در محلول نمک 85% ، می توانند دوباره با ریبو کلئات منیزیم استخراج شده از همان میکروارگانیزم های دیگر ترکیب شوند تا دوباره گرم مثبت شوند. همچنین نشان داده شد که یک ریبونوکلئوپروتئین طی یک خود کافت نسبتا کوتاه دوکسانان ولچی آزاد شد.
آنزیم هایی از پانکراس و گلبولهای سفید خون بدست آمده اند که سلولهای کشته شده گرم مثبت را به حالت گرم منفی تبدیل می کنند . این آنزیمها معمولا خاصیت هیدرولیز کردن اسید ریبونوکلئیک را دارند. بعلاوه یکی از آنزیم های خود کافت میکروارگانیزم های گرم مثبت که سلول را به اشکال گرم منفی تبدیل می کند نیز این خاصیت را دارد . نتایج اسپانیر و دریباس که در آنها ادعا می شد لیزوزیم سفیده تخم مرغ در مقابل اسید نوکلئیک حاوی یک عملکرد نوکلئوتیدی بود و خواص ترکیزه کافتی آنزیم را تحت تاثیر قرار میداد ، اهمیت بیشتری بدست می آورند. این نتایج ظاهرا دیگر ارزیابی و بررسی نشده اند ، متاسفانه با ترکیبات آنزیمی ناخالصی بدست آمده بودند که با آزادسازی فسفات غیر آلی هیدرولیز می کردند. در پرتو اطلاعات اخیرتر در مورد ساختار مجموعه گرم مثبت و ماهیت آنزیمهای قادر به تحت تاثیر قرار دادن تبدیل سلولهای گرم مثبت به اشکال گرم منفی ، بررسی واکنشهایی که زمانی اتفاق می افتند که این تغییر بواسطه تاثیر لیزوزیم روی سلولهای کشته بوجود می آید مورد توجه بود .
تهیه آزمایشی لیزوزیم
لیزوزیم طبق روش آلدرتون و دیگران ( 1945 ) از سفیده تخم مرغ جدا می شد. به خاطر کمبود مواد آغاز کننده ، برای شکل دادن آنزیم هیچ تلاشی صورت نگرفت . فعالیت ترکیبات ، همانطور که بواسطه روش گلدزورتی و فلوری نسبت
به ریزترکیزه لیزودکتیکوس تعیین شد ، بین 5000 میلی گرم / واحد 6000 بود. محلول آنزیم مورد استفاده حاوی lmg لیزوزیم بود .
تاثیر لیزوزیم روی ارگانیزم های گرم مثبت از بین رفته با حرارت
ترکیب سلولهای از بین رفته با حرارت ، کشت های دوکسانان ولچی بطور ناهوازی در 2% ماده آبکی پیتن ، گلوکز در 37 درجه رشد می یافتند . سلولها در سانتریفوژ شارپلز بعد از 18 ساعت کشت ، برداشت می شدند. استرپتوکوک فیکالیس و گونه های استافیلوکوک و ریزترکیزه روی 2% آگار پیتون در بطرهای روکس 37 درجه رشد می یافتند و بعد از 24 ساعت در آب مقطر برداشت می شدند. گونه های استرپتوکوک اروز مورد استفاده . اخیرا از نمونه های بیماری زا انسانی جدا شدند ، ریزترکیزه ها ارگانیزم های پوده زی جدا شده از پوست و هوا بودند.
ارگانیزم های تفکیک شده با آب مقطر شسته می شدند ، در آب مقطر معلق می شدند و در 80 درجه بواسطه حرارت از بین می رفتند . سلولهای از بین رفته ، مخصوصا سلولهای دوکسانان ولچی تهیه شده بواسطه صرفا فرو بردی یک تعلیق باکتری گرم مثبت در حمام آب در 80 درجه برای 30 دقیقه مناسب نبودند. چون نمونه های آزمایشی رنگی وجود درصد متغیری از اشکال گرم منفی را آشکار می کردند.
روشی که در نهایت اتخاذ شد روش استریل کردن ناگهانی دوبوس و مک لود بود که در آن مقدار کمی از مواد معلق باکتری به حجم زیادی آب مقطردر 80 درجه اضافه می شد. بعداز 30 دقیقه در این دما ، مواد معلق سرد می شود ، تفکیک می شودو سلولها در آب مقطر معلق می شوند. این حقیقت که سلولهای گرم مثبت در تعلیق آبی هنگام حرارت داده شدن در 80 درجه به حالت گرم منفی تبدیل می شوند حاکی از این است که ترکیبات مجموعه گرم مثبت می تواند بطور ضعیف پیوسته باشند. معمولا ، مقدار لیزوزیم مورد نیاز برای تبدیل سلولهای گرم مثبت کشته شده با حرارت به حالت گرم منفی بطور قابل توجهی بیشتر از مقدار مورد نیاز برای کافتن مواد معلق زنده ریزترگیزه لیزوریکتیکوس بود. روش نهایتا اتخاذ شده به شرح زیر بود.
موارد معلق سلولهای از بین رفته به محلول لیزوزیم m2/0 تثبیت گر فسفات 0PHV/ و آب نمک فیزیولوژیکی اضافه شد بطوریکه کدری نهایی به مقدار استاندارد سولفات باریم مک فارلاند 10/0 نزدیک بود. حجم مشابه مواد معلق سلولی به مجرای کنترل که حاویm 2/0تثبیت گر فسفات PHV/. و آب نمک فیزیولوژیکی بود اضافه شد. تولوش بعنوان محافظ استفاده می شد. چون آن روی فعالیت لیزوزیم تاثیری نداشت . مجراها در 37درجه بهتر کشت می شدند. بعد از دوره های مناسب ، مواد معلق بواسطه این روش تفکیک می شدند و نمونه
های آزمایشی رنگی تکرار می گردیدند ، در صد تقریبی سلولهای گرم منفی بطور بصری ارزیابی می شد.
نتایج ( جدول 1 ) نشان می دهد که همه ارگانیزم های از بین رفته گرم مثبت ، به استثنای مخمر ، بطور کاملتر یا نه چندان کامل گرم منفی می شد. مواد معلق استرپتوکوک فاکالین و استافیلوکوک آروز نیزموجب کرکینه شدن می شدند. تاثیر مشابهی که جذب سطحی آنزیم بواسطه سلولهای باکتری با ساختار کلوئیدیشان نسبت داده شده ، با تعلیق ارگانیزم های زنده مشاهده شده است . اجسام باقیمانده سلولهای گرم منفی بعد از عملکرد لیزوزیم در همه موارد بواسطه تریپسین که روی ارگانیزم های گرم مثبت سالم بدون تاثیر بود ، حل می شدند.
پاتوژنی چون باکتری های پوده زی نسبت به کافتندگی بواسطه لیزوزیم مستعدتر از ارگانیزم های پاتوژنی تلقی می شوند، این مسئله مورد توجه است که سلولهای از بین رفته با حرارت گونه های پاتوژنی استافیلوکوک آروز مانند ریزترکیزه های پوده زی نسبت به عملکرد لیزوزیم مستعد بودند.
PH بهینه برای تاثیر لیزوزیم روی دوکسانان از بین رفته با حرارت ولچی و استافیلوکوک آلباس محلول لیزوزیم در آب فیزویولوژیکی با مقادیر گوناگون PH با محلولهای استات M 2/0 یا فسفات M 2/0 تثبیت می شد. تعلیق شسته و
یکسان ارگانیزم های گرم مثبت از بین رفته با حرارت به هر یک از مجراهای زنجیره ها افزوده می شد. بعد از 72-48 ساعت کشت ، تعلیق ها تفکیک می شدندو نمونه های رنگی آماده شده تکرار می شدند نتایج (جدول 2 ) نشان می دهند که با هر ارگانیزم تبدیل به حالت گرم منفی در PH بهینه بود. این مقدار دقیقا با مقدار (602 PH ) تعیین شده با روش مول بعنوان بهینه برای کافتندگی تعلیق های ریزترکیزه لیروز ریکتیکوس بواسطه این آنزیم مطابقت می کند.
تاثیر لیزوزیم روی اسید ریبونوکلئیک
با در نظر گرفتن ادعاهای اسپالیزودریباس که لیزوزیم حاوی نوکلئوتیداز است و با در نظر گرفتن این حقیقت که آنزیم هایی که با اسیدریبوکلئیک هیدرولیز می کنند نیز سلول های مرده را از گرم مثبت به گرم منفی تبدیل می کنند ، ترکیبات لیزوزیم برای فعالیت ریبونوکئاز بررسی شد.
ترکیبات لیزوزیم برای فعالیت هیدرولیزی در مقابل ریبونوکلئات سدیم %1/0 در تثبیت گراستاتM 2/0,PH6 , با روش داویدسون و ویموت بررسی شدند . اسید ریبونوکلئیک ته نشین شده با واکنشگر اسیدتری کلرواستیک – استات اورانیل مک فادین بعد از کشت با آنزیم بعد از 6 ساعت تفکیک شد ، با استات اورانیل %125/0 در اسیدتری کلرواستیک شسته شد و بواسطه روش رنگ سنجی الن برای فسفر کلی تجزیه و تحلیل شد .
جدول 2 و جدول 3 در جزوه انگلیسی ص 264
رنگها بااستفاده از فیلترهای 608 فورد II با نور سنج جذب سطحی اسپکر مقایسه شدند . نتایج ( جدول 3 ) نشان میدهند که لیزوزیم فعالیت ریبونوکلئازی ندارد .
آزاد سازی شکر کاهنده طی تاثیر لیزوزیم روی سلولهای از بین رفته با حرارت
هرچند در این معین سازی ها تنها افزایش نسبتا کمی در شکر کاهنده بدست آمد ، روش اسکافر – هرتمن تجزیه و تحلیل مورد استفاده توام با شناساگر نشاسته ای گلوکولات اخیرا شرح داده شده . نتایج درست و تجدید پذیری می داد. اصلاح و تغییر سوموگی رضایتبخش نبود چون تغییرات در محلول مسی قلیایی استاندارد طی زمان رخ نداد.
آزمایش های کنترلی نشان دادند که هنگامی که محلول های لیزوزیم یا تعلیق های سلولهای از بین رفته تنها کشت می شدند هیچ آزاد سازی مواد کاهنده ای رخ نمی داد. با این وجود وقتی که تعلیق های سلول های از بین رفته با لیزوزیم کشت می شدند ، مقدار کمی گرم منفی شکر کاهنده ، همانطور که بواسطه آزمایشات زیر نشان داده میشود ، آزاد می شدند ( جدول 4 ).
استافیلوکوک آلباس سلولهای حاصل از …. لوله روکس کشت بیست وچهار ساعته این ارگانیزم به آب مقطر منتقل می شدند وبواسطه روش ( استریل سازی
ناگهانی ) از بین می رفتند . سلولهای شسته شده در آب مقطر به تثبیت گر استات M2/0و PH6 و لیزوزیم افروده می شدند و تعلیق حاصل در حضور تولوئن در 37 درجه کشت می شد. در فواصل مناسب طی تغییر از گرم مثبت به گرم منفی ، نمونه های تعلیق برداشته می شدند و در سرعت بالا تفکیک می شدند تا زمانیکه شناورها آشکار میشدند و از سلولها رها می شوند . پس شکر کاهنده 5ml ( همچنین گلوکز ) ( جدول 4 ) در هر محلول با روش اسکافر- هارتمن تعیین میشد. دوکسانان ولچی .سلولهای حاصل از 600ml کشت آبی 18 ساعته جمع می شدند ( سانتریفوژ ) ، با آب مقطر شسته می شدند و بواسطه روش استریل سازی ناگهانی از بین می رفتند. تعلیق سلولها در آب مقطر به لیزوزیم در تثبیت گر استات M2/0و PH6 اضافه شد و در حضور تولوئن در 37 درجه کشت شد. تحلیل هایی برای شکر کاهنده طی تبدیل از گرم مثبت به گرم منفی ؛ همانطور که بالا شرح داده شد ، انجام شد ونتایج ثبت شده در جدول بدست آمد.
تاثیر لیزوزیم روی کربوهیدراتهای استافیلوکوک لیمویی ودوکسانان ولچی خاص
کربوهیدراتهای مورد استفاده ، ترکیبات ناخالص جداشده بواسطه روشهایی بودند که در مورد استافیلوکوک ، ترکیبات رنگی گرمی ارگانیزم را از بین نمی بردند و از مورد دوکسانان ولچی ساختار سلولی را از بین نمی بردند ، هر چند
واکنش گرمی منفی می شد. بنابراین پلی ساکارید بعنوان ترکیبات سطحی سلولهای باکتری تلقی می شوند.
کربوهیدرات حاصل از استافیلوکوک سیتروز (B9) .از چندین روش مورد بررسی برای جداسازی پلی ساکارید ، یعنی استخراج با هیدروکسید سدیم N5./0 در 60 درجه ، اسید هیدروکلریک N 6./0 در 100 درجه برای 30 دقیقه ، کولیک سدیم 2/0 در 60 درجه و آب مقطر در 100 برای 5 ساعت ، دریافت شد که آخرین روش بهترین نتایج را می داد. این روش به شرح زیر بود :
رشد از بطرهای روکس یک کشت 48 ساعته استافیلوکوک سیتروز در آب مقطر برداشته میشد. این تعلیق از طریق پشم شیشه تصفیه می شد و سپس تفکیک می گردید . سلولها دوبار با آب مقطر شسته می شدند ، در آب مقطر معلق می شدند و برای 5 ساعت در 100 درجه گرم می شدند ، سرد می شدند و تفکیک می شدند . اسید استیک به شناور افزوده می شدتا 5/3 PH حاصل شود ورسوب حاصل بعد از 2 ساعت برداشته می شد. استات سدیم در صافی حل می شدو پلی ساکارید ناخالص با افزودن اتانول ته نشین شد. بعد از 24 ساعت ، رسوب جمع میشد ( سانتریفوژ) ، در آب مقطر معلق می شد ، و اسید ترکلرواستیک 50% افزوده می شد. رسوب تشکیل شده بعد از سی دقیقه برداشته می شد و کربوهیدرات با افزودن اتانول دوباره از صافی جدا می شد.
بعد از 48 ساعت رسوب جمع می شد در آب مقطر حل می شدو فرآیند بالا تکرار می شد تا با اضافه کردن اسیدتری کلرواستیک هیچ مواد دیگری ته نشین نمی شد . سپس محلول در مقابل آب شیر برای 48 ساعت دیالیز می شدو تصفیه می گردید . استات سدیم در صافه حل می شد و سپس پلی ساکارید بواسطه افزودن اتانول ته نشین می شد. رسوب بعد از 48 ساعت جمع می شد، بااتانول شسته می شد و با اتانول و اتر خشک می گردید.
سلولهای حاصل از کل 120 بطری روکس 400mg پلی ساکارید ، مثل یک پودر سفید که دارای [ ]D = +160 درآب بود ، حاصل شد. محلول های آبی واکنش بیورت منفی می داد و قبل از هیدرولیز غیر کاهنده بودند. کربوهیدرات از دوکسانان ولچی . سلولها از 101 کشت 18 ساعته دوکسانان ولچی با آب مقطر شسته می شدند و در هیدروکسید سدیم N 5% معلق می شدند . تعلیق در 60 درجه برای هجده ساعت حفظ می شد و سپس تفکیک می شد. اسید استیک به شناور آشکار اضافه می شد تا 35PH حاصل کند و رسوب حاصل بواسطه تصفیه بعد از 2 ساعت برداشته می شد. پلی ساکارید ناخالص ته نشین شده از صافه با افزودن اتانول بواسطه جز به جز کردن مکرر با اسیدتری کلرواستیک ، همانطور که بالا شرح داده شد ، تصفیه می شد. در نهایت پلی ساکارید با اتانول ته نشین می شد، با اتانول شسته می شدو با اتانول و اتر خشک می شد.
سلولهای حاصل1. 40 رسانه کشت 313 mg پلی ساکارید خاص را بعنوان پور سفیدی که در آب [ ]D+5/. نشان می داد ، تولید می کرد. کربوهیدرات به آسانی در آب و محلولهای آبی متراکم ارائه دهنده چسبندگی بالا قابل حل بود و بواسطه سولفات مثل ، استات اورانیل و کلرید آهن در محلول ته نشین می شد. قبل از هیدرولیز آن کاهنده نبود. با …. هیدرین ، واکنش ضعیف مثبت حاصل می شد ؛ اما با اضافه کردن 5% اسیدتری کلرواستیک به محلول آبکی متراکم هیچ ته نشینی ای رخ نمی داد.
محلولهای آبکی این بخش های پلی ساکارید تطبیق یافته با PH در 37 درجه با لیزوزیم در حضور تولوئن کشت می شدند. در فواصل زمانی نشان داده شده در جدول 5 وml5 از بخشها برداشته می شدند و برای شکر کاهنده طبق روش اسکافر – هارتمن بررسی می شدند. نتایج ( جدول 5 ) نشان می دهند که هر دو هیدرات خاص استافیلوکوک سیتروزودوکسانان ولچی بواسطه لیزوزیم تا حد کم اما مشخصی هیدرولیز می شدند.
نخست محلولهای کربوهیدرات و لیزوزیم کاملا خالص و رها از ذرات موجود در تعلیق بودند ؛ اما در کشت محلولهای ترکیبی پلی ساکارید و آنزیم ؛ ته نشینی بعد از 24 ساعت رخ می داد. این نظریه احتمالا روی پدیده کرکینه سازی باکتری بواسطه لیزوزیم تاثیر دارد.
از این نتایج به نظر می رسد که وقتی لیزوزیم روی سلولهای از بین رفته با حرارت عمل می کند ، درصد کمی از شکر کاهنده از مواد کربوهیدرات واقع شده در سطح سلولها آزاد می شود . در تاثیر این ، یافت شد که مواد کاهنده بواسطه تاثیر لیزوزیم روی سلولهای دوکسانان ولچی که بواسطه استخراج با کولیک سدیم به گرم منفی تبدیل شده بودند ، فرآیندی که مشخص است بواسطه کاهش اسید ریبونوکلئیک و کربوهیدرات از سطح سلول انجام می شود ، آزاد نمی شدند.
چون تبدیل سلولهای گرم مثبت به اشکال گرم منفی مشخص است شامل برداشتن اسید ریبونوکلئیک از سطح سلول می باشد، بنابراین از نتایج آزمایشی بدست آمده به نظر می رسد که این تغییر باید بطور همزمان با هیدرولیز مواد کربوهیدرات سطحی ای بوقوع پیوندد که وقتی سلولهای مرده بواسطه عملکرد لیزوزیم به گرم منفی تبدیل می شوند ؛ رخ می دهد . این موردی است که بواسطه آزمایشات زیر ثابت می شود که در آنها ذرات از مواد آزاد شده بواسطه عملکرد و تاثیر لیزوزیم روی استافیلوکوک آلباس و دوکسانان ولچی از بین رفته با حرارت جدا می شدند. و در هر صورت خواص یک اسید ریبونوکلئیک را داشتند.
جداسازی اسید ریبونوکلئیک از مواد آزاد شده از استافیلوکوک آلباس و دوکسانان ولچی از بین رفته با حرارت طی تغییر ایجاد شده با لیزوزیم از گرم مثبت به گرم منفی :
استافیلوکوک آلباس :تعلیق سلولهای استافیلوکوک آلباس گرم مثبت از بین رفته با حرارت از بطری های روکس 20 در آب مقطر ، در تثبیت گر استات m2/. ، ./6PH تولوئن با لیزوزیم کشت میشد تا زمانی که سلولها کاملاً گرم منفی شوند سپس مواد معلق تفکیک میشوند و اسید نوکلئیک ناخالص بواسطه افزودن مقدار برابر استات اورانیل % 25/. در % 5/2 محلول اسید تری کلرواستیک در شناور خالص ته نشین می شد . رسوب بواسطه تفکیک بعد از 18 ساعت صبر کردن جمع می شد ، در آب مقطر معلق می شد و m5/. کربونات سدیم افزوده می شد مواد نامحلول بعد از 5 دقیقه با سانتر یفوژ برداشته می شد و شناور خالص با n 5/. اسید استات دارای5/2PH می شد بعد از 18 ساعت رسوب تفکیک می شد در آب مقطر معلق می شد و m./5 کربونات سدیم افزوده می شد ، تا زمانی که محلول کاملی حاصل می شد ، سپس اسید استیک ./6 PH افزوده می شد و محلول تفکیک می شد سپس استات لاستانیم قطره وار به شناور خالص افزوده می شد تا زمانیکه دیگر ته نشینی رخ ندهد .
ماده جامد بعد از 18 ساعت در سانتر یفوژ جمع می شد ، در آب مقطر معلق می شد و بواسطه اضافه کردن قطره وارm5/. کربونات سدیم حل می شد . جداسازی کربونات لانتانیم طی زمان رخ می داد . بعد از 6 ساعت ، تعلیق تفکیک می شد و رسوب یکبار با آب مقطر حاوی کمی کربونات سدیم شسته می شد .
شناور ترکیب شده با 5/2 PH با اسید هیدروکلریک تطبیق می یافت و رسوب حاصل بعد از 18 ساعت جمع می شد . رسوب با اتانول شسته می شد و با اتانول واتر خشک می شد . بازده mg43 پودر قهوه ای روشن بود .
دوکسانان ولچی ، سلولهای حاصل از 61 ، یک کشت 16 ساعته دوکسانان ولچی جمع می شدند ، یکباره آب شسته می شدند ، در آب مقطر معلق می شدند و در 80 درجه از بین می رفتند . تعلیق سلولها در آب مقطر در 37 درجه با لیزوزیم در m2/. تثبیت گراستات ، ./6 PH و تولوئن کشت می شد تا زمانیکه سلولها کاملاً گرم منفی می شدند سپس تعلیق تفکیک می شد و شناور خالص با افزودن استات اورانیل + واکنشگر اسید تری کلرواستیک ته نشین می شد . تصفیه رسوب طبق روش فوق بازده mg 65 پودر قهوه ای روشن داشت .
بنابر این ترکیبات حاصل از استافیلوک آلباس و دوکسانان ولچی حاوی در صد بالایی خاکستر بودند (جدول 6 ) که رنگ سبز داشت ، درصد این مواد غیر آلی (احتمالاً ارائه شده بعنوان ناخالص های موجود در استات لانتانیم ) در شکنه استافیلوکوک می توانست بواسطه دیالیز محلولی از مواد موجود در کربونات سدیم رقیق از 26 به % 19کاهش یابد اما نمی توانست بطور کامل برداشته شود . خواص شکنه اسید نوکلئیک از استافیلوکوک آلباس و دوکسانان ولچی
آمار تحلیلی ( تصحیح شده برای خاکستر ) یافته شده برای دو ترکیب در جدول 6 ثبت می شدند و با مقادیر تئوری محاسبه شده برای اسید ریبونوکلئیک فرمول C28 H49 O29 N5 P4 مقایسه می شوند .
جدول 6 ص 268 جزوه انگلیسی
نشانه دیگر برای شناسایی این شکنه ها با اسیدریبونوکلئیک بواسطه حقایق زیر فراهم می شد. ترکیبات درmM 26% نشاندهنده نوارهای جذب سطحی قوی ای بود که ، بعد از اصلاح تفاوتها در حجم خاکستر ، با نوارهای جذب سطحی مفروض بواسطه یک محلول چگاله اسیدریبونوکلئیک خالص مشابه آنچه که بواسطه هنری و استاکی شرح داده شده بود ، مطابق بود.
ترکیبات بواسطه ریبونوکلئاز می باشد ، از پانکراس گاو طبق روش کونیتز هیدرولیز می شوند. هیدرولیز شکنه های ایجاد شده با آنزیم در PH طبق روش داویدسون و ویموت دنبال می شد. هر مجرای مجموعه های آرمانیسی حاوی 5/0 ml محلول ریبونوکلئاز در آب مقطرM 2/0 تثبیت گراستات PH6/0و ml 2/0 محلول اسید نوکلئیک باکتری 1% حل شده در M 001/0 کربونات سدیم بود و با PH6 با اسید هیدرولیک N 001/0 تطبیق می یافت . ( شکل 2)
با در نظر گرفتن ویژگی ریبونوکناز و بطور خاص با در نظر گرفتن این حقیقت که آن بواسطه اسید دی اکسی ریبونوکلئیک مورد حمله واقع نمی شد ، این نتیجه
، توام با آمار تحلیلی ، شناسایی شکنه های باکتری با اسید ریبونوکلئیک را بوجود می آورد. ترکیبات می توانستند بواسطه استخراج باکولیک سدیم 5% در 60 درجه دوباره با سلولهای تبدیل شده به گرم منفی پیوند یابند. با این روش اسید نوکلئیک جدا شده از استافیلوکوک دوباره با اجزای ساختارهای سلولی گرم منفی دوکسانان ولچی و اسیدنوکلئیک جداشده از دوکسانان ولچی با ساختارهای سلولی گرم منفی مخمر پوشانده می شدند.
هنری واستاسی به نمک منیزیم تبدیل می شد . بانمونه های کوچک اسیدهای نوکلئیک موجود باکتری ، این روش رضایتبخش یافت نشد و روش های دیگر بررسی شدند.
شکل 2 ص 270 جزوه
چون محلول ریبونوکلئات منیزیم اصلی ، برای منیزیم واکنشهای یونی ارائه می دهند ، به نظر ممکن می رسید که محلول ریبونوکلئات سدیم در حضور یون منیزیم همانند ریبونوکلئات منیزیم در آزمایشات پیوند مجدد موثر و کارامد عمل کند . دریافت شد که حضور یون سدیم هیچ تاثیر بازدارندگی ای روی ترکیب ریبونوکلئات مینیزیم با اجزای ساختارهای درونی کاهیده دوکسانان ولچی نداشت . بعلاوه در نتیجه آزمایشات کمیتی که در آنها اجزای ساختارهای درونی دوکسانان ولچی کاهیده به محلولهای رقیق زنجیره ریبونوکلئات سدیم در
حضور M 012/0 سولفات منیزیم افروده می شدند تا طبق شماره 100 به میزان کدری سولفات باریم استاندارد کدری دهد ؛ اثبات شد که بنابراین mg 2/0-1/0 اسید ریبونوکلئیک در هر میل محلول می توانست کم آشکار شود. بر خلاف اجزای ساختارهای درونی گرم منفی بدست آمده توسط استخراج کولیک سدیم از ارگانیزم های گرم مثبت ؛ سلولهای کشته تبدیل شده به گرم منفی با تاثیر لیزوزیم و سپس کاهش یافته با فرمالدئید نمی توانستند دوباره با ریبونوکلئات منیزیم ترکیب شوند. چون نتایج قبلی نشان داده بودند که لیزوزیم تاثیری روی سلولهای گرم منفی با کولیک سدیم نداشت ؛ سلولهای تبدیل شده به گرم منفی بواسطه لیزوزیم در معرض استخراج با نمک زرداب بودند.
استخراج سلولهای تبدیل شده به گرم منفی بواسطه عملکرد و تاثیر لیزوزیم با کولیک سدیم
سلولهای استافیلوکوک گرم منفی باقیمانده بعد از عملکرد لیزوزیم در 60 درجه در %5 کولیک سدیم معلق می شدند. بعد از 5 روز ، تعلیق تفکیک می شد و شناور خالص ( بیوت مثبت ) سرریز می شد. سلولهای باقیمانده دوباره با آب مقطر شسته می شدند و سپس در آب نمک معمولی %2 یک شبه معلق می شدند.
طی این دوره ؛ مواد معلق بعنوان یک رسوب کرکی پیوند می زدند و جدا می شدند ؛ هر چند تجزیه و فروپاشی سلولها رخ نمی داد. بعد از تفکیک سلولها سه
بار با آب مقطر شسته می شدند و سپس دوباره %4 ریبونوکلئات منیزیم معلق می شدند. نمونه های آزمایشی رنگی درست شده از سلولها بعد از 24 ساعت و 48 ساعت در دمای اتاق ؛ در هر صورت ، گرم منفی بودند ، و نشان می داد که اجسام سلول قادر به ترکیب مجدد با اسید ریبونوکلئیک نبودند.
اتانول خالص با N 5 اسید استیک به عصاره کولیک سدیم افزوده می شدو رسوب حاصل بعد از 18 ساعت در سانتریفوژ جمع می شد. مواد جامد در آب مقطر معلق می شدند و بعد از 20 دقیقه مواد معلق در دمای اتاق تفکیک می شدند. مواد نا محلول دوباره با آب مقطر استخراج می شدند. عصاره آبی ترکیبی واکنش مولیک مثبت اما بیورت منفی ارائه می دادند. شکنه نامحلول واکنش بیورت مثبت و مولیک منفی ارائه می داد.
افزودن مقدار برابر %25 /0 استات اورانیل در اسیدتری کلرواستیک 5/2 به جداسازی رسوب کمی می انجامید که بعد از 6 ساعت جمع می شد. (شناور ، واکنش مولیک منفی ) . از این رسوب ؛ بواسطه روش قبلا توضیح داده شده ؛ شکنه ای جدا میشد که مانند اسید ریبونوکلئیک شناسایی می شد. بواسطه این حقیقت که آن نمی تواند به نمک سدیم تبدیل شود و دوباره با ساختارهای درونی گرم منفی دوکسانه ولچی در حضور یون سدیم ترکیب شود تا خواص رنگی گرمی اولیه را بازگرداند .
شکنه II بعد از خشک کردن با اتر و اتانول mg10 پودر قهوه ای روشن می داد که در آب و اسیدهای رقیق نامحلول بود اما در قلیاهای رقیق محلول بود. آن واکنش ساکاگوچی ،نین هیدرین و بیورت مثبت اما آزمایشات مولیک ، سولفور و میلون منفی ارائه می داد و به نظر می رسید یک پروتئین اسیدی یا پلی پپتید باشد.
مباحثه
از میکروارگانیزیم های گرم مثبت در معرض عملکرد لیزوزیم ؛ ثابت شده که تنها مخمر نسبت به عملکرد این انزیم مقاوم است . بنابراین به نظر می رسید که بین ساختارهای مجموعه گرمی مخمر و مجموعه گرمی باکتری تفاوتهای اساسی ای موجود باشد. نتایج آزمایشی نشان داده اند که وقتی ارگانیزم های گرم مثبت کشته مناسب بواسطه عملکرد لیزوزیم به مقادیر کم اما مشخص مواد کاهنده تبدیل می شوند؛ در محلول آزاد می شوند . یک افزایش مشابه در گروههای کاهنده زمانی رخ می دهد که محلولهای پلی ساکاریدهای خاص ارگانیزم های گرم مثبت با لیزوزیم کشت می شوند. به نظر می رسد این کربوهیدراتها در سطح سلول یا نزدیک به آن واقع شده باشند چون می توانند بواسطه روشهایی که با تغییرات موجود در واکنش رنگی گرمی یا با فروپاشی سلولها انجام می شوند ؛ جدا شوند. بعلاوه سلولهایی که بواسطه استخراج با کولیک سدیم به گرم منفی
تبدیل شده اند فرآیند انجام شده بواسطه برداشت اسید ریبونوکلئیک و پلی ساکارید از سطح سلول هنگام کشت با لیزوزیم ممواد کاهنده را آزاد نم کنند.
چون ارگانیزم های ….. گرم مثبت کامال نسبت به عملکرد تریپسین مقاوم هستند ؛ هنگامی که سلولهایی که بواسطه عملکرد آنزیم یا استخراج با کولیک سدیم به گرم منفی تبدیل می شوند ؛ کافته می شوند ؛ به نظر می رسد که مواد پروتئینی بطور معمولی در سطح سلول آشکار نمی شوند. بنابراین می تواند تصور شود که بیرونی ترین مجموعه گرم مثبت متشکل از اسید ریبونوکلئیک ؛ کربوهیدرات خاص و احتمالا لیپید می باشد. همزمان با هیدولیز نسبی مواد کربوهیدرات سطحی که هنگامی رخ می دهد که لیزوزیم روی سلولهای مرده اثر میکند ، واکنش رنگی گرمی منفی می شود و اسید ریبونوکلئیک ، عامل مجموعه مسئول ابقای نوع مثبت , در محلول آزاد می شود. این حقیقت حاکی از این است که در سلول ؛ اسید ریبونوکلئیک و کربوهیدرات بوسیله پیوندهایی که با عملکرد لیزوزیم گسیخته می شوند , در ترکیب پایدار می باشند.
جداسازی نوکلئوپروتئین گرم مثبت با خود کافتندگی نسبتا کوتاه دوکسانان ولچی ؛ هماره با یافته های مشابه برای خود کافتندگی پنوموکوک انحصارا نشان می دهد که اسید ریبونوکلئیک مجموعه گرمی نیز با پروتئین سلولی ترکیب می شود. اینکه آیا بخشی از دومی همراه با اسید ریبونوکلئیک بواسطه تاثیر لیزوزیم
از ارگانیزم های از بین رفته با حرارت آزاد می شود یانه ؛ باید مشخص شود . بنابراین نشانه بسیار بدست امده به این نتیجه گیری می انجامد که بخش اصلی این پروتئین بواسطه ساختارهای درونی سلول حفظ می شود.
چون همه ارگانیزم های گرم مثبت ؛ به استثنای سرویژیا ؛ پذیرای عملکرد لیزوزیم بودند ، هر چند مشخص است پلی ساکاریدهای این ارگانیزم ها در ساختار شیمیایی بسیار متفاوت هستند ، اما بسیار محتمل است که تاثیر لیزوزیم روی ارگانیزم های مستعد به خاطر توانایی آنزیم برای هیدرولیز پیوندهای خاص رایج برای این پلی ساکاریدها باشد. این پیونده آنهایی که بین کربوهیدرات و اسید نوکلئیک یا بین کربوهیدرات و پروتئین می باشند. در تائید این نظریه این یافته است که وقتی سلولهای باکتری یا پلی ساکاریدهای خاص این سلولها لا لیزوزیم کشت می شوند ؛ افزایش در گروههای ناکاهنده نسبتا کم است. با این وجود میروهانل بیان کرده اند که لیزوزیم در تراکم پائین ……… ریز لایه اش را با افزایش کم یا نه چندان آشکار در گروههای کاهنده کاتالیز می کند.
بر خلاف نتایج موجود ، اپسین و چاین این عقیده را داشتند که زیر لایه پلی ساکاریدشان برای لیزوزیم در اجسام باکتری های حساس به لیزوزیم گنجانده می شد و انها قادر نبودند آن را با هیپوکلریت با فرمالدئید از باکتری های سالم استخراج کنند. با این وجود چون نویسندگان توانستند کافتندگی کامل تعلیق های
ریز ترکیزه دیکتیکوس از بین رفته با حرارت را باعملکرد ترکیبی لیزوزیم و تریپسین بدست آوردند؛ با در نظر گرفتن مباحثه مذکور بدیهی است که این آنزیم موجب هیدرولیز مواد کربوهیدرات سطحی با فروپاشی مجموعه گرمی نیز می شود. تائید برای استدلال موجود با کارافیر فینر؛ میرواستینبرگ فراهم می شود که نشان داده اند ظاهرا زیر لایه لیزوزیم یکی از پادگن های ریزترکیزه لیزودیکتیکوس می باشد. با این وجود محتمل است که دو کربوهیدرات در ریزترکیزه لیزودیکتیکوس موجود باشد ؛ که هر در پدیرای عملکرد لیزوزیم هستند ؛ یکی بخش تشکیل دهنده مجموعه گرمی و دیگری شامل بخش بدنی سلول می شود.
پیدایش اتفاقی موماد کربوهیدرات در اجسام سلولی ریزترکیزه لیزودیکتیکوس که می توانند بواسطه لیزوزیم کاملتر هیدرولیز شوند تا بواسطه کربوهیدرات مجموعه گرمی ؛ می توانند تا حدودی تفاوت موجود در آسیب پذیری نسبت به این آنزیم را که بین ریزترکیزه لیزودیکتیکوس و اکثر ارگانیزم های دیگر وجود دارد را توضیح دهند.
توضیحات در مورد صفحه
این توضیحات از چاپ ها خشک مستقیم گرفته شده از نگاتیوه روی صفحات همه رنگ و حساس به نور فرآیندی سریع مهیا می شوند. سلولهای باکتری رنگی با روش گرمی , تا قطر 1000 بزرگ می شوند.
شکل 1 . دوکسانان ولچی گرم مثبت از بین رفته با حرارت
شکل 2 . سلولهای دوکسانان ولچی تبدیل شده به گرم منفی بواسطه عملکرد لیزوزیم
شکل 3 . سلولهای گرم منفی نشان داده شده از شکل 2 ؛ تصفیه شده با %2 محلول ریبونوکلئات منیزیم
شکل 4 . سلولهای دوکسانان ولچی بواسطه استخراج با محلول کولیک سدیم %2 در 60 درجه به گرم منفی تبدیل شدند. پپتون های دیگر در رسانه کشت به جای پپتون باکتری شناسی اوانز استفاده شد و در گفت و شنود بعدی کاملتر مورد بحث واقع می شود.
شکل 5 . سلولهای گرم منفی نشان داده شده در شکل با % ریبونوکلئات منیزیم پیوند داده می شود.

فایل : 26 صفحه

فرمت : Word