مقاله در مورد مطالعه بيان ژن هاي کاسپاز3 وbaxدر سلول هايLNCapتحت القاي کمپلکس VO-Salen

سپاسگزاري
شکر و امتنان پاک يزدان الهي، که مرا توفيق علمآموزي عطا فرمود و لحظه لحظه در اين راه ياريام نمود.
از پدر و مادر مهربان و عزيزتر از جانم که دعاي خيرشان در تمام زندگي بدرقه راهم بوده و موفقيتهايم مرهون زحمات بيکرانشان ميباشد.از خواهر و برادران عزيزم نيز کمال تشکر را دارم.
برخود لازم ميدانم از استاد راهنماي بزرگوار و گرانقدرم، جناب آقاي دکتر صابر زهري که راهنمايي اين پاياننامه را بر عهده داشتند و در تمام سختيها و مشکلات، قدم به قدم همراه و پشتيبانم بوده و با صبر وحوصله اينجانب را راهنمايي نمودند مراتب تشکر و سپاسگزاري را داشته باشم. از جناب آقاي دکتر ابوالفضل بضاعت پور، که از مشاورههاي ارزشمندشان بهرهمند شدم، سپاسگزارم. از داور خارجي محترم پاياننامه، جناب آقاي دکتر فرزام شيخ زاده که قبول زحمت فرموده و پاياننامه اينجانب را اصلاح نمودند، بينهايت سپاسگزارم. از استاد ارجمندم، جناب آقاي دکتر سعيد لطيفي نويد که به عنوان داور داخلي اصلاح پاياننامهام را بر عهده گرفتند، کمال تشکر را دارم. از ساير اساتيد گروه زيستشناسي،دکتر عليرضا قاسميان و دکتر اسداله اسدي که 7 سال از محضرشان کسب فيض نمودهام، نيز کمال تشکر و سپاس را دارم. از ساير افرادي که ياريبخش پاياننامهام بودهاند، سرکار خانم زهري و سرکار خانم خيرانديش بينهايت سپاسگزارم و براي همگي آرزوي سلامتي و سربلندي را از خداوند متعال خواستارم.
بر خود لازم ميدانم از همکلاسيها و دوستان مهربانم، خانمها زينب زارعي، زهرا نزهت، زهرا معتمد، سحر محمدي،خوشه خياطي، فرح غلاميراد، سونا طلايي، بهشته شادمان، مهسا خاتمي، فريبا ملکي،پگاه و طراوت و آقايان ابراهيم اسدالهي، مهدي نجاران، آرش عبدالملکي و ديگر دوستان عزيزم که هر کدام بهنحوي يار و ياور من بودهاند، کمال سپاس و قدرداني را دارم و براي همه عزيزان آرزوي سلامتي و توفيق را از خداوند متعال خواستارم.
فهرست مطالب
عنوان…صفحه
فصل اول: مقدمه و تاريخچه
1-مقدمه 2
1 -1- سرطان 2
1-1-1- ويژگي هاي اساسي سلول هاي سرطاني 3
1-1-2-عاملهاي سرطان 3
1-1-3-ژنتيک سرطان 4
1-1-3-3- ژنهاي مهار کنندهي تومور 7
1-1-5- بررسي سرطان پروستات از ديدگاه ژنتيكي 8
1-1-6- مرگ سلولي آپوپتوزيس 9
1-1-6-1- مسير آپوپتوزيس 10
1-1-6-2- مسير خارج سلولي آپوپتوزيس 11
1-1-6-2- مسير داخل سلولي آپوپتوزيس 12
1-1-6-3- تنظيم مسير داخلي آپوپتوزيس از طريق پروتئينهاي خانواده Bcl2 13
1-1-7-ماشين آپوپتوتيک 15
1-1-7-1-کاسپازها و مسيرهاي آپوپتوتيک 16
1-1-7-1-1-ساختار کاسپازها و فعاليت آنزيماتيک 16
1-1-7-1-2-ساختار پروکاسپازها 16
1-1-7-1-3- ساختارهاي كاسپازهاي فعال 17
1-1-7-1-4-کاسپازهاي عمل کننده 18
1-1-8-كمپلكسهاي سالن 19
1-1-8-1-کمپلکسهاي نوع سالن 20
1-1-8-1-1-جنبههاي عمومي کمپلکسهاي سالن 20
1-1-8-1-2-کمپلکسهاي قابل حل در آب سالن 21
1-1-8-1-3-کمپلکس آهن سالن 21
1-1-9- Real Time PCR 22
1-1-10-مقايسه ي Real Time PCR و PCR معمولي 22
1-1-11 -فازهاي PCR 23
1-1-12-اصول RT-PCR به شيوهي معمولي و Real Time 24
1-1-13- Real Time PCR يک مرحلهاي يا دو مرحلهاي 24
1-1-14-مرحله ي نسخه برداري معکوس در RT-PCR 25
1-1-15-مرحله واکنش زنجيرههاي پليمراز در RT-PCR 26
1-1-16-مفاهيم Real Time PCR 27
1-1-16-1-خط پايه 27
1-1-16-2-چرخه آستانه 27
1-1-16-3-منحنيهاي استاندارد 28
1-1-17-تئوري Real Time PCR 29
1-1-17-1- روشهاي مختلف تعيين کميت به وسيلهي Real Time PCR 30
1-1-17-1-1-تعيين کميت مطلق 30
1-1-17-1-2-روش منحني استاندارد براي تعيين کميت نسبي 30
1-1-17-2-منحني ذوب و پرايمر دايمرها 30
1-1-17-2-1-پرايمر دايمرها 31
1-1-17-2-2-اثر پرايمر دايمرها بر PCR کمي 32
1-1-18-رنگهاي متصل شونده به DNA 32
1-2- پيشينهي تحقيق 33
فصل دوم: مواد و روشها
2ـ مواد و روش‌ها 42
2ـ1ـ ابزار مورد استفاده 42
2ـ2ـ رده سلولي 42
2ـ3ـ مواد مورد استفاده 42
2ـ3ـ1ـ بافر PBS 42
2ـ3ـ2ـ محيط كشت RPMI 1640 43
2ـ3ـ3ـ آنتي بيوتيك 43
2ـ3ـ4ـ محيط كشت فريزينگ 43
2ـ3ـ5ـ محلولMTT 43
2ـ3ـ6ـ بافر گلايسين 44
2ـ3ـ7ـ محلول استوك EDTA (5/0 مولار) 44
2ـ3ـ8ـ بافر X5 TAE (Tris- Acetic acid-EDTA) 44
2-3-9- بافر بارگذاري 44
2-3-10- پرايمرهاي مورد استفاده 45
2-3-11-کيت Real Time PCR SYBR GeenI 45
2-3-12- سنتز کمپلکس VOS و 5BMVOS 45
2-3-12-1- سنتز ليگاند شيف‌باز H2L1: 46
2-3-12-2- سنتز كمپلكسVOL1: 46
2-3-12-3- سنتز ليگاند H2L2 46
2-3-12-4- سنتز کمپلکس VOL2 : 47
2-3-13- ساير مواد 47
2-4- روشها 48
2-4-1- تعويض محيط کشت 48
2-4-2- کشت مجدد سلولها 48
2-4-3- ذخيره و نگهداري بلند مدت سلولها 49
2-4-4- حيات مجدد سلولها 51
2-4-5- شمارش سلولها با تريپان بلو 51
2-4-6- سنجش حيات سلولها با آزمون MTT 52
2-4-7-استخراج RNA 52
2-4-8- الکتروفورز RNA بر روي ژل آگاروز 54
2-4-9-روشهاي آشکار سازي RNA 54
2-4-10-RT-PCR 55
2-4-11- واکنش Real Time PCR 56
2-6-3- اجزاي تشکيل دهندهي واکنش در Real Time PCR 56
2-7- روش مورد استفاده براي تعيين کميت 57
فصل 3 نتايج
3- نتايج 59
3-1- بررسي اثر آنتي اکسيداني salen 59
3-2بررسي اثرات سيتوتوكسيسيتي و ضد تكثيري salen، VOS و 5BMVOS بر روي لاينهاي سلولي LNCaP 60
3-2-1 بررسي کسر ماندگاري سلولها با استفاده از آزمون MTT 60
3-2-1-1-نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثيرVOS بر روي لاينهاي سلولي LNCaP 60
3-2-1-2مطالعات مورفولوژيکي سلولهاي تيمار شده با VOS استفاده از تصويربرداري با ميکروسکوپ اينورت 61
3-2-2- 1- نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثير Salen بر روي لاينهاي سلولي LNCaP 62
3-2-2- 2- مطالعات مورفولوژيکي سلولهاي تيمار شده با Salen 63
3-2-3-1- نتايج حاصل از آزمون MTT توسط تاثير 5BMVOS بر روي لاينهاي سلولي LNCaP 64
3-2-3-2- مطالعات مورفولوژيکي سلولهاي تيمار شده با 5BMVOS 65
3-3- نتايج حاصل از استخراج و بارگذاري RNA بر روي ژل آگارز 66
3-4- نتايج حاصل از Real Time PCR 68
3-4-1بررسي منحني ذوب مربوط به ژن GAPDH به عنوان ژن خانهدار، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تيمار 68
3-4-2- منحني استاندارد ژن GAPDH ، کاسپاز3 ، bax و bak قبل و بعد از تيمار: 70
3-4-3- منحني تکثير ژنها 71
3-4-3منحني تکثير ژنهاي ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR از تيمار با VOS 71
3-4-4منحني تکثير ژنهاي ژنGAPDH ،کاسپاز 3 ، bax و bak در دستگاه Real Time PCR قبل و بعد از تيمار با 5BMVOS 72
3-4-5- نتايج حاصل از آناليز دادهها با استفاده از روش2-ΔΔCt 74
3-5- نتايج حاصل از بارگذاري PCR بر روي ژل آگارز 2 درصد 75
3-5-1-نمونههاي تيمار شده با VOS 75
3-5-2-نمونههاي تيمار شده با 5BMVOS 75
3-6- اثر مهاري DMSO , Salen و VOS بر روي آنزيم Taq DNA پليمراز 76
فصل 4 : بحث و نتيجهگيري
4- بحث ………………78
منابع………….……………………………………………………………..83
فهرست شکل ها
عنوان………………………….………………………………………………………………صفحه
شکل(1-1): مسير درون سلولي و خارج سلولي آپوپتوزيس. 12
شکل(1-2): دمينهاي پروتئينهاي خانوادهي Bcl-2 15
شکل (1-3) : منحني تکثير فازهاي PCR 24
شکل (1-4): منحني تکثير فازهاي PCR با استفاده از يک سريال رقتي 28
شکل(1-5): منحني استاندارد ايجاد شده (لگاريتم (رقت)/CT ) با استفاده از سريال رقتي 29
شکل(1-6): نحوهي اتصال رنگ سايبرگرين به رشتههاي DNA در طي PCR 59
شکل(3-1): بررسي اثر آنتياکسيداني Salen 59
شکل(3-2): بررسي غلظتهاي 75 ،150 ،300 ،600 ،900و1120 ميکرو مولار VOS بر روي لاين سلولي LNCaP 61
شكل(3-3) : بررسي تصاوير مورفولوژيكي تاثير غلظت هاي مختلف VOS برروي لاين سلولي LNCaP 62
شکل(3-4): بررسي غلظتهاي 93،186،373 ،699 ،1119و1492 ميکرو مولار Salen بر روي لاين سلولي LNCaP 63
شكل(3-5) : بررسي تصاوير مورفولوژيكي تاثير غلظت هاي مختلف Salen برروي لاين سلولي LNCaP 64
شکل(3-6): بررسي غلظتهاي8/38، 6/77، 2/155، 5/310و 1/621 ميکرو مولار 5BMVOS بر روي لاين سلولي LNCaP 65
شكل(3-7) : بررسي تصاوير مورفولوژيكي تاثير غلظت هاي مختلف 5BrMVOS برروي لاين سلولي LNCaP 66
شکل(3-8): الف- مثالي از الكتروفورز حاصل از RNA تام استخراج شده از سلولهاي تيمار شده 67
شکل(3-9): منحني ذوب الف( GAPDH )، ب(cp3)، ج(bak) ، د(bax) 69
شکل(3-10): نمودار استاندارد الف(GAPDH)، ب(کاسپاز3)، ج(bak)، د(bax) 70
شکل(3-11): منحني تکثير ژنهاي الف(GAPDH) ، ب(کاسپاز 3) ، ج(bax) ، د(bak). 72
شکل(3-12): (الف)منحنيهاي تکثير ژنهاي bak- GAPDH، (ب)کاسپاز3-GAPDH، (ج) bax-GAPDH. …………………………………………………………………………………………………………………………………. 73
شکل(3-13): (الف) بار گذاري محصول PCR مربوط به ژن bak ، (ب) ژن کاسپاز 3روي ژل آگارز 2 درصد 75
شکل(3-14): (الف) بار گذاري محصول PCRمربوط به ژن bax و GAPDH، (ب) ژن کاسپاز 3 روي ژل آگارز 2 درصد 76
شکل(3-15): اثر Salen، VOS و DMSO بر آنزيم taq polymerase در واکنش PCR ……76
فهرست جداول
عنوان………………………………………………………………………صفحه
جدول 2-1 آنتيبيوتيكهاي مورد استفاده و عملكرد آنها 43
جدول 2-2 توالي و خصوصيات پرايمرهاي استفاده 45
جدول 2-3 مواد استفاده شده 47
جدول2-4 مواد مورداستفاده در PCR معمولي و مقادير آنها 56
جدول 2-5 اجزاي تشکيل دهندهي يک واکنش PCR ………………………..……..56
جدول3-1 جذب نوري در محدوهي RNA تام ٢٦٠ و غلظت نمونههاي تيمار شده با VOS ……73
جدول 3-2 جذب نوري در محدوهي RNA تام ٢٦٠ و غلظت نمونههاي تيمار شده با 5BMVOS. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….73
جدول 3-3 نتايج حاصل از آناليز دادهها با استفاده از روش2-ΔΔCt ………………………..74
Abbreviation
DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium

فایل : 103 صفحه

فرمت : Word